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16s rdna 测序

16s rdna测序


16s rdna测序是利用高通量测序技术对样品微生物的16s rdna扩增产物的片段进行测序,能够对特定条件下细菌种类和丰度进行有效的鉴定。16s rdna 指细菌基因组中编码核糖体16s rrna分子对应的dna序列。16s序列由9个高变区组成,中间是保守区,是最常用的细菌分类标准。通过提取环境样品的dna,扩增其中16s rdna基因,可以鉴定绝大多数细菌。基于illumina miseq平台的16s rdna测序可以一次性完成多个样本的平行测序,可以进行样品中细菌多样性、物种丰度、种群结构和系统进化等诸多信息分析。

1、实验方案

    测序策略:illumina miseq pe300/pe250

    数据量:推荐5万条clean reads

2、技术优势

(1)准确性高:从碱基保守水平测定,真实反映物种情况。

(2)快速高效:相比于传统鉴定方法,16s测序鉴定微生物更快速和准确。

(3)过程简单:环境样品的最优凯发k8娱乐真人旗舰厅的解决方案,完全摆脱繁杂的菌株分离工作。

(4)灵敏度高:可以鉴定到低丰度细菌。

(5) 降低成本:需测序数据量少,检测成本低。

3、数据分析

1)按标准流程进行数据整理及数据质量评估。

2tags拼接、过滤

3)物种组成分析(与rdpsilvagreengene等数据库比对);

4otu统计及venn图分析

5otu rank曲线

6)物种积累曲线

7)物种注释及其丰度分析(柱状图和热图分析)

8)物种系统进化分析

9)单个样本复杂度分析(α多样性分析);

10)样本间/组间α多样性差异统计分析及盒形图;

11)样品间复杂度分析:β多样性heatmap分析

12)β多样性pcoa分析(2d/3d

13nmds-2d/3d分析

14)样本组间差异分析:adonis分析,相似性分析,rda/cca分析等。

15)不同样本间物种组成聚类分析(样品数≥3

4、技术流程


5、案例分析

案例(1)多发性硬化病与肠道微生物组的关系

       肠道微生物对于免疫系统的功能发挥着重要的意义,同时与多种自身免疫疾病相关。beth isreal deaconess医疗中心的人员使用miseq和454测序仪,通过对60例ms(多发性硬化疾病)患者和43例健康人进行肠道16s rrna测序并分析,发现ms患者的肠道中methanobrevibacter和akkermansia两种菌丰度增高,同时还伴有butyricimonas的丰度降低。接受治疗后,患者肠道中prevotella和sutterella的丰度有所上升,sarcina有所降低。提示了肠道微生物的菌种改变有助于发现ms起病原因。

1 ms患者和健康人肠道微生物的差异分析


案例2 红斑狼疮患者兼患牙周炎龈下牙垢16s rdna测序揭示口腔微生物的多样性

红斑狼疮是免疫系统疾病,很多患者会同时患有口腔疾病。该研究募集了52例sle患者(伴有牙周炎35例,无牙周炎17例)和52例非sle对照(伴有牙周炎28例,无牙周炎24例);共采集104份龈下牙垢,提取总dna后,利用illumina miseq平台行16s rdna测序v4区域。sle患者牙周炎发生地更加普遍且更严重,且年龄更小。sle会影响口腔微生物的多样性。在患有牙周炎的群体中,sle患者较对照组口腔微生物多样性低。微生物的相互关系分析中,非sle对照样本共鉴定到89个细菌关联,而sle患者样本中共发现了111个细菌关联。


图1 对照组(红色)和非牙周炎sle样本(绿色)具有不同相对丰度的otu




参考文献

[1] jangi et al. alterations of the human gut microbiome in multiple sclerosis. nature communications, 2016.

[2] corrêa et al. subgingival microbiota dysbiosis in systemic lupus erythematosus: association with periodontal status. microbiome, 2017.